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三、新一代DNA测序技术

2018-08-09 22:25编辑:qdkasite.com人气:


DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域,很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。过去三年,大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术,这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一,还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。目前,新的测序技术及手段还在不断涌现,比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格,更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。今后,各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段,这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。

DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。迄今为止,我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。在过去5年间,人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展(表2)。

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1. 具有代表性的新一代DNA测序仪

最近市面上出现了很多新一代测序仪产品,例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法(cyclic-array sequencing),也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。

所谓循环芯片测序法,简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应(模板变性、引物退火杂交及延伸)以及荧光序列读取反应。2005年,有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。与传统测序法相比,循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势,于是很快就获得了广泛的应用。

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虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同,而且各有特点(表3),但实际上它们背后的原理和技术都是非常相似甚至是相同的(图1b)。新一代测序法首先也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子,然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库,也可以使用配对标签(mate-paired tag)制成跨步文库(jumping libraries)。随后可以通过原位polony(in situ polony,小词典1)、微乳液PCR(emulsion PCR)或桥式PCR(bridge PCR)(图5)等方法获得测序模板。

上述方法有一个共同点,那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的:原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处,在微乳液PCR法(emulsion PCR)中所有的产物都集中在微珠的表面。真正的测序反应本身和传统测序法一样,是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成(图6)。本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法(sequencing by synthesis),即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列,最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析,获得序列结果。

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注:虽然目前测序片段长度短和准确率不高这两个缺点限制了新一代测序技术的应用,不过应该坚信,我们最终一定会克服这些问题。就好像经过了30年的努力,传统的测序技术也今非昔比,到达了今天的水平一样。
1.1    454测序仪

454测序仪的出现极大促进了测序业务的开展,科研人员已经将测序技术作为解决科研工作中许多常见问题的利器。这是因为454测序仪在以下几个方面取得了质的突破:首先是解决了高通量测序问题;其次它简化了样品准备步骤,将以往转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外PCR扩增法替代了;最后, 幸运飞艇,它缩小了测序反应体积,节省了试剂。这样,454测序仪做到了以极其低廉的价格进行大规模平行测序反应。它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测序仪无法匹敌的。454测序仪与其它的新一代测序仪一起,降低了测序检测的费用,推动了测序技术平民化进程,使得小实验室也能开展测序检测项目,打破了以往只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的“垄断地位”。在过去的18个月里,由于有了454测序仪的帮助,人们对人类基因组的结构有了更深入的了解,同时第一次使用非Sanger测序法对个人进行了测序,还建立了一种发现小RNA的新方法。不过,要能让更多的人使用上新一代的测序产品,它们还需要变得更便宜,并且更加容易操作。在一段时间之内,454测序仪必定会进一步降低测序费用,帮助人们迎接个人基因组时代的到来。

(来源:中国仪器网)

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